重症肌无力患者外周血中CD4+C25+调节性T细胞的变化及意义

孙怡、乔健、吕传真、赵重波、朱新梅       重症肌无力（MG）是一种T细胞依赖的，抗体介导的神经系统自身免疫病，大量乙酰胆碱受体的抗体(acetylcholine receptor antibody,AchRAb)蓄积于神经肌肉接头处，干扰正常神经递质的传递，从而导致肌无力的发生。AchR反应性的CD4+T细胞被认为是MG发生的重要原因，因为这些致病性自身反应性T细胞可以辅助B细胞产生AchR抗体。大部分MG患者有胸腺异常（>90%），其中大约85%为胸腺增生，15%为胸腺瘤。胸腺切除往往可以缓解MG的临床症状。尽管如此，胸腺在MG发病中的作用尚未明了。     CD4+C25+调节性T(Tr)细胞是维持机体免疫耐受的重要因素之一，它由胸腺产生后输出至外周，并通过主动调节（dominant regulation）的方式抑制存在于正常机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，从而防止自身免疫性疾病的发生。大量的研究提示，CD4+C25+Tr细胞的数量减少或功能异常均有可能导致自身免疫病的发生。目前有关CD4+C25+Tr细胞在MG中作用的研究尚少。为探索CD4+C25+Tr细胞在MG发病中的作用，我们采用三色流式细胞术分别对MG患者和正常对照组外周血CD4+C25+T细胞的比率进行了检测和比较。     1 材料与方法     1.1 研究对象  MG组：29例MG患者均为本院门诊或住院病人，根据典型的临床表现，新斯的明试验，肌电图检查确诊。其中男12例，女17例子，年龄15～65岁，平均38岁。病程1个月至24年；该组患者中，眼肌型15例，全身型14例，其中有12例患者正在接受免疫抑制剂[糖皮质激素和（或）环磷酰胺]治疗，17例患者在近3个月内未应用免疫抑制剂；7例患者施行了胸腺切除术，且均为术后1年以上病人。对照组：健康志愿者23例，男11例，女12例，年龄20～60岁，平均38岁，均无近期感染或自身免疫病史。     1.2 单抗试剂　CD3-FITC，CD25-R-PE和CD4-TC单克隆抗体用来鉴定CD4+CD25+Tr亚群，阴性对照为IgG2a-FITC,IgG1-R-PE和IgG2a-TC,所有单抗均为Caltag Laboratories产品。     1.3 标本采集及制备  于上午8：00～10：00采集2ml肘静脉血，EDTA抗凝，6h内进行细胞表型分析。采用标准的全血-裂解法，即取抗凝全血100μl，加入适量的荧光标记抗体，混匀后室温闭光反应20min，经溶血、稀释和固定后，24h内用流式细胞仪（Coulter EPICS）检测，SYSTEM Ⅱ软件获取数据和分析。以CD3-SS设门，分析门内CD4+CD25high细胞亚群，每份标本计数30000个CD3+细胞，结果以CD4+CD25+细胞CD4+细胞的百分率表示。     1.4 统计学分析　所有资料均采用SPSS10.0统计软件，进行t检验和直线相关分析。以P<0.05为具有统计学差异。数据表达采用均数±标准差表示。     2 结果     2.1 MG组和对照组CD4+CD25+T细胞百分率的比较　病情未能很好控制的MG患者外周血中CD4+CD25+T细胞比率略低于健康对照组（P=0.12）；病情稳定或缓解的MG患者CD4+CD25+T细胞比率显著高于健康对照组（P=0.0001）（表1）。性别、年龄与CD4+CD25+T细胞表达不相关。     表1  MG组与对照组外周血中CD4+CD25+T细胞百分率的比较（%）   组别 例数 CD4+CD25+ 病情稳定或缓解① 17 8.45±1.96* 病情控制不佳② 12 3.79±1.40 健康对照组 23 4.53±0.96     与对照组相比，*P<0.05     ①指经正规免疫抑制剂治疗后临床症状改善或基本消失1年以上的MG患者；②包括经正规免疫抑制剂治疗至少1年而临床症状无明显改善的MG患者和未经正规治疗且病情逐渐进展的MG患者     2.2  不同临床分型MG患者CD4+CD25+T细胞百分率的比较   眼肌型MG患者与全身型MG患者的CD4+CD25+T细胞百分率分别为（6.76±2.85）和（6.27±3.04），二者比较无统计学差异（P=0.653）。     2.3　胸腺切除对MG患者外周血CD4+CD25+T细胞的影响  胸腺切除的MG患者CD4+CD25+T细胞的百分率显著高于未经胸腺切除的MG患者和健康对照组，P值分别为0.044和0.0001(表2)。     表2　胸腺切除的MG患者与胸腺未切除的MG患者以及健康对照组CD4+CD25+T细胞百分率的比较（%）   组别 例数 CD4+CD25+ 胸腺切除 7 8.44±2.39 胸腺未切除 22 5.88±2.89* 健康对照组 23 4.53±0.96**  与胸腺切除的MG患者相比，*P<0.05、**P<0.01     2.4  免疫抑制剂对CD4+CD25+T细胞的影响   经和未经免疫抑制剂治疗的两组MG患者CD4+CD25+T细胞的百分率分别为（6.22±3.08）和（6.47±2.71），二者比较无统计学差异（P=0.818）。     3 讨论     MG是一种T细胞依赖的，抗体介导的自身免疫病，胸腺在其发病的过程中起着举足轻重的作用。几乎所有的MG患者有胸腺异常（>90%），而MG患者的胸腺中存在大量激活的自身反应性CD4+T细胞；然而，胸腺在MG发病中所起的确切作用机制尚未可知。     CD4+CD25+T细胞是一群起源于胸腺的，存在于正常机体内的（约占循环CD4+细胞的5%～10%），具有抑制自身反应性T细胞活化的调节性T细胞。将去除了CD25+T细胞的CD4单阳性细胞转移给免疫缺陷的小鼠可导致宿主发生各种自身免疫病，若同时输入CD4+CD25+T细胞则不会诱发自身免疫病。此外，小鼠出生后3d切除胸腺可发生自身免疫病，发现其体内CD4+CD25+T细胞亚群缺失，给这些小鼠过继转移CD4+CD25+T细胞则可预防自身免疫病的发生。 在风湿性关节滑液内存在大量的CD4+CD25+T调节性T细胞，Cao等认为这一现象可能与慢性炎症的发生、发展和转归有关；Sullivan等发现患有先天性胸腺功能低下的患儿外周血CD4+CD25+T细胞的绝对计数显著低于正常婴儿，推测这些患儿易发生自身免疫病与其在发育早期严重缺失CD4+CD25+T细胞亚群有关。     综上，我们提出假设：MG患者胸腺的异常可否导致CD4+CD25+调节性T细胞数量减少和（或）功能失常，从而使自身反应性CD4+T细胞大量被激活，辅助B细胞产生自身抗体，参与MG的发病过程呢？本研究发现，病情未能很好控制的MG患者外周血CD4+CD25+T细胞比率轻微降低，而病情稳定或缓解的MG患者CD4+CD25+T细胞显著升高；此外，胸腺切除的MG患者外周血中CD4+CD25+T细胞水平显著高于未经胸腺切除的MG患者和健康对照组，这些结果为我们的假设提供了可能的依据。Schwartz等认为，当机体接受外来致病因子的侵袭时，抑制性CD4+CD25+T细胞和致病性CD4+CD25-T的比例将决定自身免疫反应的起始、程度和病程。因此，我们认为，对于病情未能很好控制的MG患者来说，因其体内不能产生足够量的CD4+CD25+Tr细胞来抑制大量激活的自身反应性T细胞，疾病就迁延、加重、以至恶化；而当机体能产生足够量的CD4+CD25+Tr细胞来对抗自身反应性T细胞时，MG病情就趋于稳定或缓解；此外，胸腺切除的MG患者外周血中存在高比例的CD4+CD25+T细胞可能与病情的缓解有关。但是，既然胸腺是产生CD4+CD25+T细胞的主要部位，为何胸腺切除后CD4+CD25+T细胞的比例反而增高呢？有三种可能可以解释这看似矛盾的结果：首先，可能来自CD4+CD25-T细胞的体内扩增：体外研究发现，CD25-T细胞激活后可以转化成CD25+T细胞；其次，胸腺切除后，调节性T细胞与自身反应性T细胞不成比例的缺失以及成熟T细胞群体的外周扩增也可能导致CD4+CD25+T细胞的比例增高；还有一种可能就是由残留的胸腺组织产生。     总之，我们的研究结果表明：MG患者外周血中存在异常比例的CD4+CD25+调节性T细胞，可能参与了MG的发生和发展，继续深入的研究（包括对于同一患者，在病情不同时期的CD4+CD25+调节性T细胞的比例以及功能的研究）将有助于我们更好的理解MG的发病机制，也将成为MG的免疫治疗提供新的思路。