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重症肌无力患者胸腺细胞凋亡障碍与Fas 表达异常的关系

 

www.shouxi.net　　杜英, 张清勇 , 阮丽荣 , 梁长春 , 李倩如 , 何炜 2004-8-21 17:29:39 细胞与分子免疫学杂志

 

 

 

Tel . (0371) 6912523 , Email :duyingde @hotmail . comThe relationship between abnormalapoptosis and Fas expression of thymo2cytes in patients with myasthenia gravisDU Ying1 , ZHANG Qing2yong2 , RUAN Li2rong1 , LIANGChang2chun3 , LI Qian2ru1 , HE Wei41Department of Microbiology and Immunology , Zhengzhou University ,Zhengzhou 450052 ;2Department of Thoracic Surgery , The Second Af2filiated Hospital of Zhengzhou University , Zhengzhou450003 ;3Department of Neurology , Anyang People’s Hospital , Anyang455000 ;4Department of Physilogy , Zhengzhou University , Zhengzhou

450052 , China

 

 

Abstract

 

 

AIM: To explore the role s of abnormalitie s of thymocyticabnormal apopto sis and its Fas expre ssion in patients withmya sthenia gravis (MG) in generation of autoimmune re sponse.METHODS : The thymocyte s were isolated and thymus extrac2tive wa s prepared from fre sh thymic tissue excised from MG pa2tients. The proliferation of thymocye s wa s evaluated by MTTcolorimetry. The apopto sis of thymocyte s were examined byDNA electrophore sis. Expre ssion of Fas wa s analyzed by a

FACScan flow cytometry. Transcription and mutation of Fasgene were detected by RT2PCR and ingle2stranded conforma2tion polymorphism ( SSCP) analysis. RESULTS : Thymus ex2tractive could inhibit proliferation of normal thymocyte s , whilehad no influence on the thymocytic roliferation of MG patients.The proliferation of thymocyte s of both normal persons and MGpatients could be inhibited by thymus extractive in the pre senceof dexametha sone . The inhibition rate s were 58. 33 % and 54.26 % re spectively. The cocultured thymocyte s with dexametha2sone showed haracteristic apopto sis pattern and the DNA elec2trophore sis exhibited‘ladder’appearance . The abnormal bandsin Fas mRNA of partial MG patients’thymocyte s were found byRT2PCR2SSCP analysis. CONCLUSION: Abnormalitie s ofapopto sis and Fas gene expre ssion of MG patients’thymo2cyte s , and Fas gene mutation may be related to the pathogene2sis and progre ssion of MG.

 

 

Keywords : mya sthenia gravis ; thymocyte ; Fas ; apopto sis

 

 

摘要目的: 探讨重症肌无力(MG) 胸腺细胞凋亡异常、Fas 表达异常在自身免疫应答形成中的作用。方法: 用手术切除的MG患者的胸腺, 制备胸腺提取液和胸腺细胞悬液, 用MTT 比色法测定胸腺细胞的增殖; 用DNA 电泳及细胞形态学观察细胞凋亡; 用流式细胞仪检测细胞表面Fas 的表达, 用RT2PCR 结合单链多态构象性分析(SSCP) , 探讨Fas 基因的转录及可能存在的Fas 基因突变。结果: MG患者的胸腺提取液, 能抑制正常胸腺细胞增殖, 但不能抑制MG患者胸腺细胞增殖。在地塞米松作用下, 正常人及患者胸腺细胞的增殖均可被抑制,细胞增殖抑制率分别为58. 33 %和54. 26 %。MG患者胸腺细胞的DNA 电泳可见梯状条带, 并且胸腺细胞上Fas 的表达百分率增加[ (20. 38 ±6. 07) %] , 与空白对照组[ ( 12. 43 ±4. 32) %]相比较P < 0. 05。对MG患者胸腺细胞Fas mRNA 进行RT2PCR2SSCP 分析, 部分MG 患者出现异常电泳条带。结论: MG患者胸腺细胞的凋亡及Fas 分子表达均异常, 而且存在Fas 基因突变, 提示与本病的发生发展有关。

 

 

关键词: 重症肌无力; 胸腺细胞; Fas ; 细胞凋亡

 

 

中图分类号: R392. 9 　　　文献标识码: A

 

 

　　Fas 是肿瘤坏死因子超家族的成员, 在细胞凋亡中发挥重要作用, 尤其是Fas 分子能从多方面调节免疫应答。在外周免疫中, Fas/ FasL 相互作用可控制细胞介导的细胞毒作用,免疫细胞活化引起的细胞死亡等。在胸腺, Fas 能通过调节胸腺细胞阴性选择而影响自身反应性胸腺细胞的凋亡[1 ,2 ] 。某些自身免疫性疾病的发生, 也往往通过不同的机制与Fas 基因及其表达异常有关[3 ,4 ] 。重症肌无力(myasthenia gravis , MG)

属于器官特异性的自身免疫学疾病, 由于体内出现抗乙酰胆碱受体的抗体(AchR2Ab) , 影响体内神经肌肉接头处的神经传递而发病, MG患者存在明显的胸腺异常。为深入探讨胸腺与MG的关系, 了解胸腺细胞功能异常的机制, 我们对MG患者胸腺细胞的增殖、Fas 分子的表达、以及Fas 基因异常等进行了研究。

 

 

1 　材料和方法

 

 

1. 1 　材料　研究对象: 经临床确诊及病理鉴定的胸腺增生型MG患者18 例, 男11 例, 女7 例, 年龄2～14 岁, 平均9. 13岁。10 例先天性心脏病患者(对照组) , 男8 例, 女2 例, 平均7. 8 岁。试剂及仪器: 小牛血清为杭州四季青生物材料厂产品。Thiazolyl blue(MTT) 为Fluka 公司产品。分别用FITC、PE 和CY标记的小鼠抗人Fas、CD4、CD8 单克隆抗体(mAb) 为Pharmingen 公司产品。地塞米松为Sigma 公司产品。RP2MI1640 、TRLzol 试剂和Superscript IITM逆转录酶试剂盒, 均为Gibco 公司产品。Taq DNA polymerase 为TaKaRa 公司产品。酶

联免疫检测仪(DG3022A 型) 为国营华东电子管厂产品。稳压稳流电泳仪(DYY2III25) 为北京六一仪器厂产品。流式细胞仪(FACS can 型) 为美国Becton Dickison 公司产品。PCR 扩增仪为Perkin2Elmer 公司产品。

 

 

1. 2 　方法

 

 

1. 2. 1 　胸腺细胞悬液和胸腺提取液的制备　无菌取少许胸腺组织, 去筋膜和血污后剪碎, 经100 目不锈钢网轻轻研磨,制备胸腺细胞悬液。另将其用组织匀浆器制备胸腺组织匀浆, 经2 000 r/ min 心15 min 和0. 25μm微孔滤膜过滤, 制成胸腺提取液, 置- 20 ℃保存备用。

 

 

1. 2. 2 　胸腺细胞增殖实验　将胸腺细胞悬液用含10 mg / LPHA2P、150 mL/ L 小牛血清的RPMI1640 液调整细胞密度为2 ×109/ L , 并将其加至96 孔平底培养板中, 每孔100μL。实验组加入胸腺提取液50μL 或地塞米松1 ×10 - 5 mol / L , 每组设3 个重复孔, 对照组不加胸腺提取液和地塞米松, 置37 ℃CO2 细胞培养箱中培养8、16、24、32、40 及48 h , 用MTT比色法和酶联免疫检测仪于波长570 nm测定吸光度值( A 值) , 并按下列公式计算细胞增殖的抑制率。细胞增殖的抑制率( %) =(1 - 实验组A 值/ 对照组A 值) ×100 %。所得数据均用

SPSS10. 0 软件进行分析处理, 绘出折线图。

 

 

1. 2. 3 　胸腺细胞凋亡的检测　按文献[6 ]的方法提取培养前后MG患者的胸腺细胞DNA , 经15 g/ L 琼脂糖凝胶电泳、溴乙锭染色后, 观察DNA 断裂条带。另外, 将培养前后的细胞经常规组织涂片、瑞氏染色后, 观察其形态变化。

 

 

1. 2. 4 　胸腺细胞Fas 表达的流式细胞仪分析　将培养前及培养24、48 及72 h 的MG患者胸腺细胞用PBS 洗涤, 并调整细胞密度为109～1011/ L。取100μL , 加入FITC2抗Fas mAb、PE2抗CD4 mAb、Cy2抗CD8 mAb 各10μL , 避光孵育20 min , 同时以同种型荧光染色免疫球蛋白作为对照调节流式细胞仪的电压, 上机检测。数据采用Cell Quest 软件分析并进行t 检验。

 

 

1. 2. 5 　胸腺细胞Fas mRNA 的提取及RT2PCR 　按TRLzol 试剂说明书, 提取培养前后MG 患者的胸腺细胞总RNA , 用无RNase 的DNase I 处理消除残存的基因组DNA。按SuperscriptIITM试剂盒操作说明, 以RNA 为模板、oligo (dT) 为引物进行反转录。根据基因数据库中Fas mRNA 的序列, 设计出围绕第4～7 个外显子的引物, 以cDNA 第1 链为模板, 进行PCR(94 ℃1 min , 58 ℃1 min , 72 ℃1 min , 共35 个循环) 。引物由中科院上海生物工程制品中心合成, 引物的序列: 正义链为5′2TG2CACCCGGACCCAGAATACC23′, 反义链为: 3′2TGTTTTCTG2

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TACTTCCTTTCTC25′。

 

 

1. 2. 6 　PCR 产物的单链构象多态性分析(PCR2SSCP) 　将PCR扩增的DNA 片段, 经氯仿抽提去油、冷乙醇沉淀、抽干后, 用含950 mL/ L 甲酰胺、0. 2 g/ L 溴酚蓝的变性上样缓冲液20μL重新溶解DNA , 于95 ℃变性后, 进行100 g/ L 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳。取出凝胶, 经100 mL/ L 乙醇固定、10 mL/ L 硝酸处理和2 g/ L 硝酸银染色1 h , 再用0. 19 mL/ L 甲醛和30 g/ L碳酸钠显色及100 mL/ L 冰乙酸固定。

 

 

2 　结果

 

 

2. 1 　胸腺提取液与地塞米松对胸腺细胞增殖的影响　经PHA 刺激后能明显增殖的正常人胸腺细胞可被正常人胸腺提取液抑制; 而在PHA 刺激下发生增殖的MG患者胸腺细胞则不能被正常人胸腺提取液抑制。地塞米松可抑制正常人及患者胸腺细胞的增殖(图1) , 在培养24 h 的抑制率分别为58. 33 %和54. 26 %。图1 　胸腺提取液与地塞米松对MG患者胸腺细胞增殖的影响

 

 

2. 2 　胸腺细胞的DNA 电泳　MG患者的胸腺细胞加地塞米松后培养24 h , 提取DNA 进行琼脂糖凝胶电泳, 可见梯状条带出现(图2) 。图2 　胸腺细胞的DNA 电泳

 

2. 3 　胸腺细胞的形态学观察　MG患者的胸腺细胞加地塞米松后培养48 h , 涂片镜检, 可见胸腺细胞皱缩、细胞核浓染、变小(图3) 。图3 　MG患者胸腺细胞凋亡的形态观察

 

2. 4 　胸腺细胞表面Fas 分子的表达　MG患者CD4 + CD8 + 胸腺细胞上Fas 表达的百分率为(78. 58 ±16. 04) % , 显著低于对照组[ (89. 26 ±6. 07) % , P < 0. 01 ] ; 而CD4 - CD8 + 单阳性的胸腺细胞上Fas 的表达百分率[ (9. 13 ±4. 67) %]则高于对照组[ (4. 17 ±1. 48) % , P < 0. 05) ] 。地塞米松能诱导MG患者

胸腺细胞上Fas 的表达增加。地塞米松作用前及作用后24、48及72 h , 胸腺细胞上Fas 的表达率分别为: 9. 66 %、13. 06 %、45. 58 %和75. 96 %(图4) 。地塞米松作用48 及72 h , Fas 的表达率与未经地塞米松作用的空白对照[ (12. 43 ±4. 32) %]相比较, 有较显著的差异( P < 0. 01) 。图4 　地塞米松作用后不同时间胸腺细胞上Fas 的表达

 

2. 5 　Fas mRNA 的RT2PCR2SSCP 分析　正常人和MG患者胸腺细胞的Fas 基因均有表达, 地塞米松可使MG患者胸腺细胞的Fas 表达增加, 并出现多条电泳带, 与未经地塞米松处理组及正常人胸腺细胞组相比较有明显差异( P < 0. 05 , 图5) 。图5 　MG患者胸腺细胞中Fas mRNA 的RT2PCR2SSCP 分析

 

 

3 　讨论

 

 

胸腺细胞是一群具有明显异质性的细胞, 在胸腺微环境中逐渐由CD4 - CD8 - 双阴性的细胞发育为CD4 + CD8 + 双阳性的细胞, 再经过阳性和阴性选择发育成熟为CD4 + CD8 - 或CD4 - CD8 + T细胞, 并使T细胞获得MHC 限制性和自身耐受性。Fas/ FasL 是胸腺细胞阴性选择过程中导致自身反应性T细胞克隆消除的重要膜分子2 ,3 ] 。因此, 胸腺细胞中Fas 基因突变或其表达的异常, 均可能直接影响自身反应性T 细胞的清除而导致自身免疫性疾病的发生。MG是有明显胸腺组织结构异常的器官特异性自身免疫性疾病[7 ] 。有许多证据表明, MG患者不仅存在自身抗体, 而且存在T细胞功能的异常[8 ] 。本研究显示, MG患者胸腺提取液能抑制正常胸腺细胞增殖, 说明MG患者的胸腺提取液中存在抑制因子, 在胸腺细胞的发育增殖中起抑制作用; 但MG患者胸腺细胞的增殖不能被胸腺提取液抑制, 提示MG患者的胸腺细胞增殖异常。为探究其异常增殖的原因, 我们对新分离的MG患者的胸腺细胞, 用流式细胞仪检测其表面Fas的表达。发现MG患者CD4 + CD8 + 双阳性的胸腺细胞上Fas的表达显著低于对照组; 而CD4 - CD8 + 单阳性的细胞上Fas的表达则高于对照组, 提示MG患者CD4 + CD8 + 双阳性的胸腺细胞

刺激T 细胞活化后, 其表面Fas 分子的表达增加[1 ] 。因此,CD4 - CD8 + 细胞上Fas 表达的增高, 可能是单阳性细胞受体内自身抗原的刺激而活化; 而处于未成熟阶段的双阴性、双阳性细胞, 在接触体内自身抗原后则不被活化, 这也从另一个侧面证实, 文献[7 ]中关于在MG患者胸腺内存在自身抗原和淋巴细胞活化的报道。地塞米松是常用的免疫抑制剂, 常用于治疗重症肌无力等自身免疫性疾病。Kirsch 等[8 ]发现, 在地塞米松或抗CD2/

CD3 mAb 作用下, 活化的外周T 细胞或新分离的人胸腺细胞可发生凋亡, 但若中和了抗Fas 抗体后, 不仅可使抗CD2、抗CD3 mAb 引起的细胞DNA 链断裂减少, 而且也可使地塞米松作用的细胞DNA 断裂减少, 说明Fas/ FasL 是地塞米松引起细2 5 4 ISSN1007 - 8738 细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol) 2003 , 19(5)

胞凋亡的一种机制[9 ] 。本研究还证实, 地塞米松能抑制正常人及MG患者胸腺细胞的增殖, 使之出现凋亡特征, 并且在地塞米松作用下胸腺细胞上Fas 的表达增加, 说明地塞米松引起的细胞凋亡与Fas 的表达有关。据文献[5 ]报道, 在自身免疫性lpr/ gld 小鼠以及人类自身免疫性淋巴细胞增多症患者中, 都发现淋巴细胞的Fas 基

因突变。为了解MG患者胸腺细胞的异常增殖是否与Fas 基因突变有关, 我们对MG患者胸腺细胞mRNA 进行了T2PCR2SSCP 分析, 发现部分MG患者出现异常电泳带, 说明这些MG患者的Fas mRNA 有异常。这种异常可导致胸腺细胞凋亡障碍, 与MG的发生有关。

 

 

参考文献:

 

 

[1 ] Ju ST , Panka DJ , Cui H , et al . Fas (CD95) / FasL interaction required forprogrammed cell death after T2cell activation [ J ] . Nature , 1995 , 373 :4442375.

 

 

[2 ] Ogasawara J , Suda T , Nagata S. Selective apoptosis of CD4 + CD8 + thymo2cytes by the anti2Fas antibody[J ] . J Exp Med , 1995 , 181 : 4852496.

 

 

[ 3 ] Hershberger PA , He HL , Mccarthy SA , et al . In vitro thymocyte matura2tion is associated with reduced cellular susceptibility to Fas2mediated apop2tosis[J ] . Cell Immunol , 1998 , 185 (2) : 1342145.

 

 

[4 ] Moulian N , Bidault J , Truffault F , et al . Thymocyte Fas expression isdysregulated in myasthenia gravis patients with anti2acetylcholine receptorantibody[J ] . Blood , 1997 , 89 (9) : 328723295.

 

 

[5 ] Fisher GH , Rosenberg FJ , Straus SE , et al . Dominant interfering Fasgene mutations impair apoptosis in a human autoimmune lymphoproliferativesyndrome[J ] . Cell , 1995 , 81 : 9352946.

 

 

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[7 ] Weker H. The thymus in myasthenia gravis[J ] . Ann NY Acad Sci , 1993 ,681 : 47260.

 

 

[8 ] Qing Yi , Pirskanene K, Lefvert AK. Human muscle acetylcholine receptorreactive T and B lymphocytes in the peripheral blood of patients with myas2thenia gravis[J ] . J Neuroimmunol , 1993 , 42 : 2152228.

 

 

[9 ] Kirsch AH , Mahmood AA , Endres J , et al . Apoptosis of human T2cells :induction by glucocorticoids or surface receptor ligation in vitro and in vivo[J ] . J Biol Regul Homeost Agents , 1999 , 13 (2) : 80289.

 

 

(1郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室, 河南郑州450052 ;2 郑州大学第二附属医院胸外科, 河南郑州450003 ;3 安阳市人民医院神经内科, 河南安阳455000 ;4 郑州大学基础医学院生理学教研室, 河南郑州450052)

 

 

收稿日期:2002 - 10 - 15 ; 　修回日期: 2002 - 12 - 30

 

 

基金项目: 国家自然科学基金资助项目(No. 39970264)

 

 

作者简介: 杜　英(19622) , 女, 河南郑州人, 副教授.