实验性自身免疫性重症肌无力相关分子的研究进展

www.shouxi.net　　郝志波              李卓玉 2004-7-24 16:01:00 中华实用医药杂志 2004年6月 第4卷 第11期

 【文献标识码】 B 【文章编号】 1609-6614（2004）11-01008-03

重症肌无力（MG）是由烟碱型乙酰胆碱受体（N 2 AchR）抗体介导的，针对神经肌肉接头处突触后膜上N 2 AchR进行破坏的一种自身免疫疾病，是一种常见的神经系统自身免疫疾病。研究认为重症肌无力的发病机理主要是B细胞产生的乙酰胆碱受体抗体（AchRab）介导的体液免疫和T细胞介导的细胞免疫。脊椎动物如小鼠，大鼠等通过肌肉注射电鳐或电鳗的电器官纯化的乙酰胆碱受体（AchR）诱导产生了实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）模型。由于该动物模型在许多方面与重症肌无力患者有相似的临床症状 ［1］ ，研究实验性自身免疫性重症肌无力的发病机理对重  症肌无力发病机理的探索具有十分重要的意义。近年来已经对实验性自身免疫性重症肌无力及一些与重症肌无力相关分子的研究取得了较大进展，如主要组织相容性复合体Ⅱ类分子（MHCⅡ类分子），它影响了乙酰胆碱受体的细胞免疫和体液免疫效应;T细胞、B细胞及其产生的相关细胞因子，它们在实验性自身免疫性重症肌无力的发生中具有重要作用。

 1 MHCⅡ类分子和CD4分子对免疫系统的重要作用

实验性自身免疫性重症肌无力通过肌肉注射电鳐或电鳗的AchR而被诱导。假如选用的小鼠种属不同，诱发EAMG的机率也不相同。小鼠的MHCⅡ类基因即H-2基因，影响EAMG的敏感性［2］ 。研究发现敏感型小鼠有H-2 b 单体型小鼠［如C57BL/6（B6）或C57BL/10（B10）］和H-2 d 单体型小鼠。相对而言，H-2 p 或H-2 K 单体型小鼠对EAMG的诱导具有一定的抗性，而H-2 q 或H-2 s 单体型小鼠没有EAMG发生。MHCⅡ类分子决定AchR的细胞免疫和体液免疫效应，在EAMG病理中具有重要作用。敏感型小鼠的MHCⅡ类基因的突变或破坏均可抑制EAMG的发生。MHCⅡ类基因在EAMG病程中的重要性的直接证据来自对B6.CH-2 bm12 （bm12）和B6小鼠的研究。bm12小鼠是由B6小鼠突变而来。bm12基因仅仅在H-2基因I-A位点上发生突变，它与B6小鼠不同之处在于I-A分子β链的3个氨基酸发生突变，分别由Ile67突变为Phe，Arg70变为Gln，Thr71变为Lys。这种突变导致T细胞效应的减弱，降低了对乙酰胆碱受体及其肽段α亚基146-162的反应 ［3］ ，它们能诱导AchR免疫的B6小鼠，产生明显的淋巴增生效应。bm12与B6小鼠相比产生了较少的AchR特异性抗体IgG2a ［4］ 和IgG2b ［5］ 。总之，bm12小鼠的基因突变抑制了对AchR的细胞免疫和体液免疫效应，导致临床EAMG的发生率减小。CD4 + T细胞也参与了MG和EAMG的发生。离体实验中，抗CD4抗体抑制了AchR的专一性淋巴细胞增生;体内实验不仅抑制临床EAMG的发生，而且使建立的EAMG模型症状减轻。对重症肌无力患者使用抗CD4的抗体，症状会得到缓解。CD4基因敲除小鼠虽然存在完整的MHCⅡ类分子，但仍然抑制了EAMG的发生 ［6］ ，表明CD4细胞可能对EAMG的发病起重要作用。CD8基因敲除的小鼠，由于CD8细胞的缺乏，降低了EAMG的发生率，但与B6小鼠相比，并没有明显的减少。所以，在EAMG的发生中，CD8细胞的作用很小 ［7］ ，这表明参与AchR免疫效应的是CD4细胞，而不是CD8细胞。

2 B细胞既是抗原呈递细胞又是产生乙酰胆碱受体抗体的细胞

B细胞是体内唯一产生抗体分子的细胞。当B细胞发育未成熟时，就开始表达MHCⅡ类分子，活化的B细胞MHCⅡ类分子表达会明显增多，同时活化的B细胞还表达多种细胞因子受体，这些受体与其相应因子结合可进一步促进B的增殖与活化。由于乙酰胆碱受体抗体导致MG/EAMG的病理过程，B淋巴细胞一直被认为在MG/EAMG的发生中具有重要的作用。μ基因敲除的小鼠缺乏B细胞，用AchR免疫后，它们不能产生抗AchR抗体，进而完全抑制EAMG的发生。然而，被动转移AchR主要免疫肽段的抗体能诱导B细胞缺陷鼠产生临床的EAMG。B细胞缺失能抑制对AchR及其α亚基146-162肽段的早期淋巴细胞增生，但AchR初次免疫90天以后出现了淋巴细胞增生 ［8］ 。这表明B细胞作为抗原呈递细胞在加工和呈递AchR主要免疫区的过程中的关键作用。但是，这种缺陷小鼠的B细胞抗原呈递功能可被其他的抗原呈递细胞所弥补。

3 细胞因子在EAMG病理过程中的调节作用

近年来有许多关于细胞因子研究方面的研究报道，在这些研究中一致认为细胞因子在EAMG的发病和病程中有重要作用。在MG和EAMG发生过程中，乙酰胆碱受体抗体的产生受到许多细胞因子的调节，这些相关细胞因子分泌的增加或减少会对MG和EAMG的发生产生特异性影响。

3.1 干扰素-α和干扰素-γ 干扰素-α（IFN-α）由白细胞产生，具有免疫调节、控制细胞增殖等功能，能下调MHC-Ⅱ类分子在淋巴细胞上的表达，进而减少EAMG的发生。Deng等研究发现用IFN-α治疗EAMG小鼠可明显缓解EAMG临床症状并降低小鼠死率 ［9］ 。在离体实验中，IFN-α可使乙酰胆碱受体抗体，特别是IgG1和IgG2b异构体水平显著降低，体外实验也证明了IFN-α能够抑制淋巴细胞对乙酰胆碱受体及其主要多肽的增生效应。

IFN-γ是一种促炎细胞因子，主要是由Th1细胞所分泌，它可作用于抗原呈递细胞，增加它们的MHCⅡ类分子的表达，提高其呈递抗原的效率，诱导B细胞成熟并辅助其产生乙酰胆碱受体抗体，诱发产生EAMG症状。近交Lewis大鼠对AchR敏感，免疫后可制备EAMG模型;近交Wistar Furth（WF）大鼠不敏感，免疫后不发生EAMG;Lewis大鼠免疫前，口腔或鼻腔给予一定量的AchR，可产生免疫耐受，减少或抑制EAMG发生。有人用AchR免疫上述三种大鼠，发现与对照鼠相比，EAMG大鼠腹股沟淋巴结和脾脏中AchR诱导的IFN-γmRNA表达细胞数增多;与EAMG大鼠相比，耐受大鼠和WF大鼠腹股沟淋巴结中AchR诱导的IFN-γmRNA表达细胞数减少。这表明IFN-γ表达增高与EAMG发生有关，IFN-γ表达降低与EAMG耐受有关 ［10］ 。用AchR免疫INF-γ基因敲除小鼠 ［11］ 或者INF-γ受体基因敲除小鼠 ［12］ ，均未能诱发EAMG或导致EAMG发生率降低。它们都未能产生足够的抗AchR的特异性抗体IgG2a和IgG3。

3.2 白细胞介素 白细胞介素（IL）是由不同的白细胞产生的细胞因子，不仅介导白细胞之间的相互作用，还参与其他细胞的相互作用。研究报道认为IL-1、IL-4、IL-6、IL-10和IL-2可能与EAMG的发生有关。Huang等人的研究发现 ［13］ ，用AcdR免疫小鼠，与对照组相比，IL-1β缺乏鼠相对耐受EAMG的发生，其淋巴细胞增殖能力很低，Th1和Th2产生的细胞因子均较少，血清中乙酰胆碱受体抗体水平也较低，这表明IL-1β在诱发EAMG中的重要作用。

IL-4是典型的Th2细胞因子，是B细胞增殖分化的重要促进剂，能刺激B细胞增殖、活化，调控B细胞针对乙酰胆碱受体产生乙酰胆碱受体抗体的过程。从而促进EAMG的病情恶化。用AchR免疫Lewis大鼠，EAMG大鼠的血清中乙酰胆碱受体抗体明显增多，淋巴细胞特异性增生，淋巴组织中IL-4mRNA表达的细胞数也增高 ［14］ 。在体外实验中，人们用IL-4刺激单克隆骨骼肌细胞时也发现肌细胞在IL-4的刺激下表达的IL-15水平明显增加，而IL-5被认为是Th1细胞和NK细胞产生IFN-γ的重要刺激因子，同时作为IFN-γ拮抗因子TGF-β水平被下调 ［15］ 。IL-6由淋巴细胞，纤维母细胞等多种细胞产生，IL-10主要由Th2细胞产生，它们促进B细胞增殖、分化及产生抗体。用AchR免疫表达IL-6基因敲除鼠，临床EAMG的发生率明显低于野生鼠 ［16］ ，而用AchR免疫IL-10的转基因鼠，临床EAMG的发生率明显高于野生鼠，并有产生了大量抗乙酰胆碱受体抗体 ［17］ ，表明IL-6和IL-10针对MG和EAMG的发病机制有重要作用。IL-12是Th1细胞相关性细胞因子，具有广泛的生物学活性。用AchR免疫IL-12p40基因敲除小鼠，发现抗AchR特异性抗体IgG2a血清含量比用AchR免疫正常的B6小鼠低，且离体实验中，AchR免疫IL-12p40基因敲除的小鼠抑制了IFN-γ的产生，最终减少EAMG的发生 ［18］ 。提示IL-12基因敲除小鼠耐受EAMG与乙酰胆碱受体抗体的减少有关。

3.3 其他细胞因子 在EAMG的病程中还有其他的一些细胞因子如TNF、TGF-β等参与了这种过程。TNF根据其来源和结构分为两种:TNF-α和TNF-β。前者有单核巨噬细胞产生，后者由活化的T细胞产生，又名淋巴毒素。它们虽然在辅助性T细胞介导的乙酰胆碱受体抗体产生中不起作用，但可通过与其他细胞因子的作用共同促进EAMG的自身免疫过程。TGF-β是一个内源性免疫抑制因子，可抑制B细胞增殖和IgG及IgM分泌，下调细胞因子IFN-γ和IL-4表达，抑制自身抗原特异性T细胞分化。经鼻耐受大鼠胸腺中TGF-βmRNA表达细胞数比EAMG大鼠高，说明TGF-β表达的增高在EAMG耐受中起重要作用 ［10］ 。

4 协同刺激分子的参与

在免疫应答过程中，B细胞和CD4 + T细胞通过协同刺激分子及抗原呈递作用可彼此直接接触，并能相互诱导使之活化。在已知的免疫应答的协同刺激分子中，B7家族是最重要的分子，主要有B7-1，B7-2。B7-1，B7-2的相应配体分别主要为CD28，CTLA-4。T细胞和B细胞的活化需要有双信号的刺激。T细胞抗原识别受体与抗原呈递细胞的肽-MHCⅡ类分子的复合体相互作用，通过CD3复合分子传递第一信号。CD4 + T细胞的CD28和抗原呈递细胞上的相应的配体B7分子相互作用，向CD4 + T细胞传递协同刺激信号，使之活化，并产生多种细胞因子。B细胞可通过其B细胞抗原识别受体即表面Ig受体与蛋白质抗原结合，Igα和Igβ链与CD3分子相当，传递第一活化信号。B细胞表面表达的CD40分子与T细胞表面的相应配体分子CD40L结合，传递协同刺激信号，在此双信号的作用下，可使B细胞活化，产生抗体。

用AchR免疫CD28基因敲除小鼠，小鼠EAMG的发生率降低，且抗AchR特异性抗体IgG1水平相对减少。在AchR免疫的CD40L基因敲除小鼠中，Th1和Th1类细胞表达的细胞因子皆减少，且没有检测到乙酰胆碱受体抗体 ［19］ 。这表明CD28和CD40L在诱导EAMG发生的重要性:在对AchR的初次免疫效应中要求CD28-B7相互作用以及CD40L和CD40的相互作用。

总之，通过科学家的多年努力，对MG及EAMG的研究取得了一些进展，特别是生物化学、分子生物学与医学的交叉渗透，使得对它们的发病机理及在此过程中的多种因子的相互作用的研究更加深入，希望尽快找到能够调节多种因子间相互作用，诱导T细胞和B细胞对AchR表位特异性耐受而减轻免疫应答的综合治疗方法，从而为临床MG或者其他自身免疫疾病的研究和治疗提供理论依据。

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作者单位:030006山西大学生物技术研究所山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室

（收稿日期:2004-03-19）

（编辑青 山）